| Titel: |
Identifizierung der Quarantäneschadorganismen Mycosphaerella pini und M. dearnesii mittels molekularbiologischer Verfahren (PCR-Technik) direkt aus dem befallenen Gewebe |
| Beschreibung (dt.): |
Der Handlungsbedarf zur Durchführung der vorgeschlagenen Untersuchungen leitet sich aus dem vom BMVEL geförderten Forschungsvorhaben „Quarantäneschadpilze an Kiefern...“ ab, in dem das Ausbreitungs- und Gefährdungspotential von Mycospharella pini und M. dearnessii nachgewiesen wird. Zur Verhinderung einer weiteren Ausbreitung und unabdingbar für die Bekämpfung ist die sichere und schnelle Diagnose der Quarantäneschadpilze. Im o.g. laufenden Forschungsprojekt ist es gelungen, die Erreger sicher zu diagnostizieren. Die Identifizierung ist allerdings sehr schwierig, zeitaufwendig und setzt Expertenwissen voraus. Zudem ist das Verfahren noch mit einer möglichen Fehlerquelle behaftet, da die Pilze zuvor aus der Kiefernnadel isoliert und auf einem künstlichen Nährboden kultiviert werden müssen. Ziel der vorgeschlagenen Untersuchungen ist es daher, die Methodik so weiterzuentwickeln, dass die molekularbiologische Identifikation direkt im pflanzlichen Wirtsgewebe möglich ist und auf die zeitaufwendige und Spezialwissen voraussetzende Pilzisolierung verzichtet werden kann. Im Ergebnis des Projektes soll die Methode als Routinetest zur Verfügung stehen. |
| Ergebnis (dt.): |
Die Identifizierung der Quarantäneschadpilze Mycosphaerella pini (Anamorph: Dothistroma septospora) und M. dearnessii (Anamorph: Lecanosticta acicola) ist mir herkömmlichen Methoden schwierig, zeitintensiv und führt häufig zu Fehlbestimmungen. Durch den Einsatz moderner, molekularbiologischer Techniken wie der hier eingesetzten DNA-Extraktion mit Mikromörser und DNA-Kit, anschließender PCR und ITS-RFLP ist es gelungen, die Kiefern-nadelparasiten direkt aus dem befallenem Wirtsgewebe sicher nachzuweisen. Eine zeitaufwendige und unsichere Isolierung des Erregers auf einen künstlichen Nährboden ist somit nicht mehr notwendig. Untersucht wurden verschiedene Stadien der Krankheitsentwicklung beider Nadelparasiten, die anhand der korrespondierenden Symptomausbildung angesprochen werden konnten. Bei dem wichtigsten Schritt, der Extraktion der Pilz-DNA aus dem infizierten Nadelgewebe, kamen ein klassisches Extraktionsverfahren sowie zwei DNA-Extraktions-Kits zum Einsatz. Mit allen drei untersuchten DNA-Extraktionsverfahren konnte ein brauchbares PCR-Ausgangsprodukt erzielt werden. Der Aufwand, mit dem dies erreicht wurde, variierte je nach Verfahren jedoch erheblich. Als unkompliziert und zeitsparend erwies sich die DNA-Extraktion mittels Glas-Mikromörser in Kombination mit einem DNA-Extraktions-Kit. Im Anschluss an die DNA-Extraktion erfolgte eine PCR, bei der ITS-Primer zum Einsatz kamen. Für die eindeutig einer Pilzinfektion zuzuordnenden Krankheitssymptome der Stromabildung unter der Nadelepidermis und dem Stadium der durch die Nadelepidermis brechenden, noch nicht sporulierenden Fruchtkörper ergab sich für Dothistroma septospora ein 580 bp langes DNA-Fragment, während Lecanosticta acicola eine Bande bei 600 bp zeigte. Bei der anschließenden ITS-RFLP konnten die artspezifischen Subfragmentmuster durch Spaltung der amplifizierten DNA mit den Restriktionsenzymen Hinf I, Hae III, Hha I, Nci I und Hpa II erzielt werden. Die Nachweisgrenze des Verfahrens erstreckt sich dabei auf Krankheitsstadien bzw. Symptomausbildungen, die einen eindeutigen Hinweis auf eine Pilzinfektion geben. |
| Laufzeit: |
Beginn: 01.09.2002 / Ende: 30.11.2003 |
| Ausf. Einrichtung: |
Abteilung B-Waldschutz Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt, Göttingen |
| Förderprogramme: |
Entscheidungshilfebedarf |
| Stichpunkte: |
forst; baumschule; pflanzengesundheit; quarantäne; diagnose; pcr; kleinprojekt; , Pflanzenschutz |
