Suchergebnis in den Forschungsaktivitäten der Entscheidungshilfevorhaben
| Titel: | Machbarkeitsstudie zu Nachweis- und Identifizierungsverfahren für genomeditierte Pflanzen und pflanzliche Produkte - Teilvorhaben DETECT |
|---|---|
| Titel (englisch): | Feasibility study on detection and identification methods for genome-edited plants and plant products |
| Akronym: | DETECT |
| Beschreibung (dt.): | Das Forschungsvorhaben DETECT dient dem Nachweis der Erfüllbarkeit des Erfordernisses für GVO-Genehmigungsanträge und amtliche Kontrollen sowie Eigenkontrollen der Wirtschaft, aussagekräftige Nachweis- und Identifizierungsverfahren für in Verkehr zu bringende oder bereits in Verkehr gebrachte genomeditierte Lebens- und Futtermittel zur Verfügung stellen zu können. Es soll also die Möglichkeit eruiert werden, ob und unter welchen Bedingungen die Etablierung geeigneter Nachweis- und Identifizierungsverfahren möglich ist. Bereits verfügbare theoretische Erkenntnisse sollen anhand aussagekräftiger experimenteller Daten validiert und ergänzt werden. Erwartetes Ergebnis des Forschungsvorhabens ist die Etablierung mindestens einer Detektionsmethode, mit der vorab bekannte, durch Zielsequenz-spezifische Nukleasen erzeugte Mutationen detektiert werden können. Dafür werden das WGS, die Tiefensequenzierung von Amplikons und verschiedene PCR-basierte (qPCR, ddPCR) Methoden getestet. Die zu detektierenden Veränderungen sind vorrangig Insertionen und Deletionen (InDels) in Cas9-adressierten DNA-Motiven Zielsequenz-spezifisch mutierter Pflanzen. Mindestens eins der getesteten und optimierten Detektionsverfahren soll spezifisch und sensitiv genug sein, um Probenmaterial mit gezielt induzierten Mutationen zuverlässig und wiederholbar nachweisen zu können. Im Zuge dieses Projektes soll zudem beurteilt werden, inwiefern die Unterscheidung einer genomeditierten Linie von einer entsprechenden spontan entstandenen Mutante möglich wäre. |
| Beschreibung (engl.): | The DETECT research project aims to demonstrate the feasibility of fulfilling the requirement for GMO authorisation applications and official controls, as well as in-house controls by industry to provide meaningful detection and identification procedures for a genomic engineered food and feed to be placed or already placed on the market. The aim is therefore to determine whether and under what conditions it is possible to establish appropriate detection and identification methods for already existing mutations resulting from a target-specific nuclease. Already available theoretical knowledge will be validated and extended by relevant experimental data. The expected result of the research project is the establishment of at least one detection method with which previously known mutations generated by target sequence-specific nucleases can be detected. For this purpose, a whole genome sequencing (WGS), depth sequencing of amplicons and various PCR-based (qPCR, ddPCR) methods will be tested. The changes which will be detected are insertions and deletions (InDels) in Cas9-addressed DNA motifs of target sequence-specific mutated plants. At least one of the tested and optimised detection methods should be specific and sensitive enough to reliably and repeatedly detect sample material with specifically induced mutations. In the scope of this project it will also be evaluated to what extent it will be possible to distinguish a genome-edited line from a corresponding spontaneously generated mutant. |
| Ergebnis (dt.): | Der Anbau und Vertrieb von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) ist in der europäischen Union stark reglementiert (Richtlinie 2001/18/EG). Aufgrund der aktuellen Rechtslage ist es erforderlich Detektionsverfahren zu entwickeln, um zumindest solche Waren zuverlässig, wiederholbar und solide detektieren zu können, die bekanntermaßen Zielsequenz-spezifische Veränderungen aufweisen. Ziel des DETECT-Projektes war es, Nachweis- und Identifizierungsmethoden für Genom-editiertes Pflanzenmaterial zu entwickeln und diese Methoden zu validieren. Für dieses Projekt wurde eine Cas9-induzierte Mutante der Gerstensorte 'Golden Promise' DH1-6 verwendet, die im PDIL5-1-Gen eine 1 Basenpaar-Deletion in homozygotem Zustand aufweist. Die mittels PacBio Hifi Longread durchgeführte Genomsequenzierung der Donor-Linie 'Golden Promise' DH1-6 und der pdil5-1-Mutante zeigte, dass die in der Mutante induzierte 1 bp-Deletion vorhanden ist, aber keine Veränderungen in sogenannten Off-targets, also dem Zielmotiv ähnliche Sequenzen vorliegen. Zudem wurde gezeigt, dass keine Rückstände eines Transgens in der pdil5-1-Mutante vorhanden sind. Die Mutante wies insgesamt 48 homozygote Single Nucleotid Polymorphisms (SNPs) und 358 homozygote Indels im Vergleich mit der Donor-Linie auf, was im Bereich der Erwartungen bezüglich spontan auftretender Mutationen liegt. Es wurde gezeigt, dass durch die Genom-Editierung mittels Cas-Endonukleasen üblicherweise keine mit der Methode assoziierbaren Rückstände oder sogenannte „Footprints“ im Genom hinterlassen werden. Im Fall der pdil5-1-Mutante ist es nicht gelungen ein aussagekräftiges qPCR-Assay zu etablieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es nur in Fällen mit dafür besonders geeigneten Polymorphismen möglich sein wird, zuverlässige qPCR-Assays zu etablieren, um zwischen Wildtyp und Mutante zu unterscheiden. Dahingegen konnten ddPCR-basierte als auch Amplikon-Tiefensequenzierungs-basierte Detektionsverfahren zum Nachweis der pdil5-1-Mutante sowie der CRT1a 1 bp-Insertions Rapsmutante des Projektpartners Christian-Albrechts-Universität zu Kiel etabliert werden. Die Assays können verlässlich 0,9 % und 0,1 % Mengenanteil der jeweiligen Mutante in Mischproben nachweisen. Von den jeweiligen akkreditierten Referenzlaboren Impetus Bioscience und Planton wurden die Assays erfolgreich auf Spezifität, Selektivität und Anwendbarkeit getestet. Es war jedoch nicht möglich, ein Identifizierungsverfahren für die pdil5-1-Mutante zu entwickeln, da es keinen im Zuge der Genom-Editierung spontan entstandenen Polymorphismus gibt, der eng genug mit der gezielt induzierten Mutation gekoppelt ist. Des Weiteren wurde im Rahmen dieses Projekts ein bioinformatisches Auswertungsprotokoll für tiefensequenzierte Amplikons entwickelt. Diese Analysepipeline wurde auf dem Galaxy Server in eine benutzerfreundliche Oberfläche eingebunden und wird in Zukunft für jeden Interessierten nutzbar sein. |
| Ergebnis (engl.): | The cultivation and distribution of genetically modified organisms (GMOs) is highly regulated in the European Union (Directive 2001/18/EC). Due to the current legal situation, it is necessary to develop detection methods to reliably, repeatably and robustly detect at least those products that are known to carry target sequence-specific alterations. The DETECT project aimed to establish detection and identification methods for genome-edited plant material and to validate these methods. A Cas9-induced mutant of the barley cultivar 'Golden Promise' DH1-6 carrying a 1-base pair deletion in the PDIL5-1 gene in homozygous state, was used for this project. Genome sequencing of the donor line 'Golden Promise' DH1-6 and the pdil5-1 mutant performed by PacBio Hifi Longread technology showed that the 1-bp deletion induced in the mutant is present indeed, while no alterations were found in so-called off-targets, i.e. in sequences similar to the on-target motif. In addition, it was demonstrated that no residues of any transgene were present in the pdil5-1 mutant. The mutant had a total of 48 homozygous SNPs and 358 homozygous Indels compared to the donor line, which is within the expected range of spontaneously occurring mutations. It was shown that genome editing using Cas endonucleases does not commonly leave any residues or so-called "footprints" in the genome which can be associated with the method. It was not possible to establish a reliable qPCR assay for the pdil5-1 mutant. The results indicate that it will only be achievable to establish robust qPCR assays to distinguish between wild-type and mutant in cases involving particularly suitable polymorphisms. However, it was possible to establish a reliable ddPCR-based detection method for the barley mutant. Similarly, a ddPCR assay for the detection of Cas9-induced 1 bp insertion in the CRT1a A09 locus of homozygous progeny of a rapeseed mutant (C3E3, CAU Kiel) was established. Furthermore, a detection method based on amplicon deep-sequencing was developed for both mutants. All assays are capable of reliably detecting 0.9% and 0.1% proportions of the respective target sequence in mixed samples. The assays were successfully tested for specificity, selectivity and applicability by the accredited reference laboratories Impetus Bioscience and Planton. The procedure and results of these validations were documented in standard operating procedure (SOP) drafts. In contrast, it was not possible to develop an identification assay for the genome-edited pdil5-1 mutant due to the lack of a spontaneously co-occurring mutation coupled tightly enough with the genome-edited position. Furthermore, a bioinformatics analysis protocol for deep-sequenced amplicons was developed. This analysis pipeline was integrated into a user-friendly interface on the Galaxy Server of the IPK Gatersleben and will be available to everyone interested |
| Laufzeit: | Beginn: 01.01.2021 / Ende: 30.11.2023 |
| Ausf. Einrichtung: | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK), Gatersleben |
| Themenfelder: | Lebensmittelanalytik, food analysis |
| Förderprogramme: | Entscheidungshilfebedarf |
| Schlagworte: | Gentechnik /GVO, genetic engineering / GMO, Pflanzenzüchtung, plant breeding, Kennzeichnung, Labelling, Rückverfolgbarkeit, traceability, Gerste, barley |
| Förderkennzeichen: | 2820HS001 |
| Dokument zum Download: | Abschlussbericht.pdf (1,6 MB) Gemeinsamer Abschlussbericht.pdf (2,1 MB) ddPCR SOP-Entwurf Raps.pdf (165,3 KB) ddPCR SOP-Entwurf Gerste.pdf (227,7 KB) |
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+Weizen -Gerste
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Weizen*
Findet Datensätze, die Wörter wie "Weizen", "Weizenmehl", "Weizenbier" oder "Weizenanbau" enthalten.
"Kleegras und Grünland"
Findet Datensätze, die die exakte Phrase "Kleegras und Grünland" enthalten. Dies wäre etwa "Stickstoffkreisläufe in Kleegras und Grünland", nicht aber "Stickstoffkreisläufe in Kleegras oder Grünland".
Beachten Sie, dass die (")-Anführungszeichen, die die Phrase umschließen, Operatorzeichen sind, die der Trennung der Phrase dienen. Es handelt sich hierbei nicht um Anführungszeichen, die den Such-String selbst umfassen.
