Suchergebnis in den Forschungsaktivitäten der Entscheidungshilfevorhaben
| Titel: | Machbarkeitsstudie zu Nachweis- und Identifizierungsverfahren für genomeditierte Pflanzen und pflanzliche Produkte - Teilvorhaben RapsNMT |
|---|---|
| Titel (englisch): | Implementation of the Next Generation Sequencing (NGS) technology for the targeted detection of genome-edited oilseed rape plants and their products |
| Akronym: | RapsNMT |
| Beschreibung (dt.): | Aufgrund des Urteils des Europäischen Gerichtshofes in der Rechtssache C-528/16 vom 25. Juli 2018, fallen die genomeditierten Rapspflanzen, deren Saatgut und daraus hergestellte Produkte vollumfänglich unter die gentechnikrechtlichen Regelungen der EU. Ziel der hier vorgelegten Projektskizze sind die Implementation der Next Generation Sequencing (NGS) Technologie zum gezielten Nachweis und Identifizierung genomeditierter Rapspflanzen und darüber hinaus zur Erarbeitung eines praxisrelevanten Nachweis- und Identifizierungsverfahrens, bzw. eines Protokolls zur Rückverfolgbarkeit und Marktkontrolle der genomeditierten Rapspflanzen. Dabei wird für das Saatgut und evtl. daraus gewonnene Produkte eine Nachweisgrenze von 0.1% angestrebt, um auch geringste Spuren von GVO- Verunreinigungen nachweisen zu können. Damit leistet das Projekt einen wichtigen Beitrag, um europäisches Recht umzusetzen und durch Genom-Editing erstellte GVOs nachzuweisen. |
| Ergebnis (dt.): | Ziel des Projekts war es festzustellen, ob ein im Rahmen der geltenden Zulassungsrichtlinien für GVOs und daraus hergestellter Produkte validiertes Nachweis- und Identifizierungsverfahren für GE-Pflanzen mit entsprechendem Referenzmaterial zur Rückverfolgbarkeit und Marktkontrolle verfügbar gemacht werden kann. In diesem Teil der Machbarkeitsstudie geht es um die Bewertung der short-read Amplikon-Tiefensequenzierung mittels Illumina-Technologie hinsichtlich ihrer Eignung bekannte CRISPR/Cas9-induzierte Mutationen im Raps CRT1a-Gen nachzuweisen und falls möglich auf die verwendete Neue Mutagenese-Technik rückzuschließen (Event Identifikation). Im Raps gibt es insgesamt 4 CRT1a Gen-Loci, zwei auf den Chromosomen A01 und C01 (Off-Target Loci), sowie zwei auf A09 und C09 (On-Target Loci). Für dieses Projekt wurde das Genom der Elternlinie Mozart, sowie die beiden Mutanten C3E3 und C3E4 sequenziert. Durch eine vorläufige Auswertung des PacBio WGS mit einer durchschnittlichen Read-Länge von ca. 15 kb und 45 GB je erzeugtem Datensatz konnten alle drei bekannten Mutationen in den CRT1a Loci gefunden werden. Von diesen liegt nur die züchterisch nicht relevante -3 bp Mutation (auf Chromosom A09b) mit 3070 bp nahe genug an einem für dieses Event spezifischen Marker (der SNP T statt A ist weder im Mozart WT noch im restlichen Raps Pan-Genom zu finden). Nur mit Hilfe solch eines eng gekoppelten Markers kann versucht werden durch Kombination zweier Assays den Ursprung der Mutation auf die NMT zurückzuführen, wobei man aber immer bedenken muss, dass es durch Crossing-over leicht zu einem Kopplungsbruch kommen kann, sodass ein gerichtsfester Nachweis nicht garantiert ist. Durch das WGS konnten keine Off-Target Mutationen gefunden werden, dafür aber auf 6 unterschiedlichen Chromosomen T-DNA Fragmente des Konstrukts mit der Genschere, welches zur Erzeugung der beiden Raps-Mutanten während der Gewebekultur eingesetzt wurde. Damit sind sowohl die hier analysierte homozygote C3E3-Mutante mit fünf T-DNA Fragmenten, als auch die heterozygote C3E4-Mutante mit nur einem verbliebenen T-DNA Fragment nicht als Transgen-frei einzustufen. Sollten GE-Mutationen einmal von der GVO-Regulierung ausgenommen werden, scheint es daher angezeigt, dass NMT-Pflanzen welche z.B. mit Hilfe von Agrobakterien erzeugt wurden, vor einem Freilandversuch mittels eines long-read WGS zunächst genauer untersucht werden – zum Beweis, dass diese auch tatsächlich Transgen-frei sind. Mit Hilfe einer CRT1a Referenzkarte wurden für das Illumina-NGS zunächst Primer erstellt, welche alle 4 CRT1a Loci im Bereich der Mutationsstelle amplifizieren können, womit gezeigt werden konnte, dass es nur in den beiden On-Target Loci zu Mutationen gekommen ist und dass alle bekannten Mutationen auch in den erwarteten Verhältnissen nachgewiesen werden konnten. Mit neuen, auf die On-Target Zielkopien optimierten Primern wurden dann verschiedene Raps Linien untersucht, Populationsanalysen durchgeführt, DNA-Verdünnungsreihen und Mischungen getestet und schließlich die LOD an Saatgut-Mischungen überprüft. Der Assay zeigt keine Kreuzreaktionen mit DNAs anderer Spezies, verhält sich linear und Konzentrationsabhängig und besitzt auch die notwendige Sensitivität, um die gesetzliche Nachweisgrenze von 0,1% einhalten zu können, womit die wichtigsten Parameter für die Erstellung eines SOPs eingehalten wurden. Damit ist es durch diese Technik möglich eine bekannte Mutation nachzuweisen und durch die Erzeugung von Sequenzdaten auch eindeutig einem Gen-Locus/Subgenom zuzuordnen. Das hier entwickelte SOP erlaubt somit den Nachweis einer durch NMT erzeugten Mutation und stellt einen wichtigen Schritt in Richtung Identifizierung dar. Eine Identifizierung ist allerdings wohl nur in Ausnahmefällen möglich, denn dazu bedarf es eines eng mit der Mutation gekoppelten zweiten Markers. |
| Ergebnis (engl.): | The aim of the project was to determine whether a validated detection and identification method within the framework of the applicable approval guidelines for GMOs and their products can be made available to trace GE plants depending on corresponding reference material for market control. This part of the “feasibility study” is about evaluating short-read amplicon deep sequencing using Illumina technology about its suitability for detecting known CRISPR/Cas9-induced mutations in the oilseed rape CRT1a gene and, if possible, for concluding the applied mutagenesis technique (event identification). There are total 4 CRT1a gene loci in oilseed rape, two on chromosomes A01 and C01 (off-target loci) and two on A09 and C09 (on-target loci). For this project, the genomes of the Mozart parental line and the two mutants C3E3 and C3E4 were sequenced. All three known mutations in the CRT1a loci could be found by a preliminary evaluation of the PacBio WGS with an average read length of approx. 15 kb and 45 GB per generated data set. Of these, only the -3 bp mutation (on chromosome A09b), which is not relevant for breeding, is with 3070 bp close enough to a marker specific for this event (the SNP T instead of A is not found in either the Mozart WT or the rest of the rapeseed pan genome). Only with the help of such a closely coupled marker can an attempt be made to trace the origin of the mutation back to the NMT by combining two assays. However, one must always bear in mind that crossing-over can easily lead to a linkage break, resulting in difficulties in generating court proof evidence. By WGS we could not detect any off-target mutations, but on 6 different chromosomes, T-DNA fragments of the CRISPR/Cas construct, which was used to generate the two oilseed rape mutants during tissue culture, were found. Thus, neither the homozygous C3E3 mutant analyzed here with five T-DNA fragments nor the heterozygous C3E4 mutant with only one remaining T-DNA fragment can be classified as transgene-free. If GE mutations are ever to be exempted from GMO regulation, it, therefore, seems appropriate that NMT plants which, for example, have been produced with the help of agrobacteria, are first examined more closely using a long-read WGS before a field trial - to prove that these are actually transgene-free. With the help of a CRT1a reference map, primers were first created for the Illumina NGS, which can amplify all 4 CRT1a loci in the region of the mutation site, which showed that mutations only occurred in the two on-target loci and that all known mutations could be detected in the expected ratios. With new primers specific for the on-target target copies, various oilseed rape lines were examined, population analyses carried out, DNA dilution series and mixtures tested, and finally, the LOD of seed mixtures checked. The assay does not show any cross-reactivity with DNAs from other species, behaves linear and concentration-dependent, and has the necessary sensitivity to meet the legal detection limit of 0.1%, meaning that the most critical parameters comply with creating an SOP. The deep amplicon sequencing technique allows the detection of a known mutation and, by generating sequence data, to clearly assign it to a gene locus/subgenome. The SOP developed here thus allows the detection of a mutation generated by NMT and represents an essential step towards identification. However, identification is probably only possible in exceptional cases, as this requires a second marker that is closely linked to the mutation. |
| Laufzeit: | Beginn: 01.01.2021 / Ende: 31.07.2023 |
| Ausf. Einrichtung: | Christian-Albrechts-Universität zu Kiel - Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät - Institut für Phytopathologie - Abt. Molekulare Phytopathologie und Biotechnologie, Kiel |
| Themenfelder: | Lebensmittelanalytik, food analysis |
| Förderprogramme: | Entscheidungshilfebedarf |
| Schlagworte: | Gentechnik /GVO, genetic engineering / GMO, Pflanzenzüchtung, plant breeding, Kennzeichnung, Labelling, Rückverfolgbarkeit, traceability, Raps, rape seed |
| Förderkennzeichen: | 2820HS012 |
| Dokument zum Download: | Abschlussbericht.pdf (2,4 MB) Gemeinsamer Abschlussbericht.pdf (2,1 MB) NGS SOP-Entwurf Gerste.pdf (309,7 KB) NGS SOP-Entwurf Raps.pdf (305 KB) |
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Weizen Stroh
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Weizen*
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"Kleegras und Grünland"
Findet Datensätze, die die exakte Phrase "Kleegras und Grünland" enthalten. Dies wäre etwa "Stickstoffkreisläufe in Kleegras und Grünland", nicht aber "Stickstoffkreisläufe in Kleegras oder Grünland".
Beachten Sie, dass die (")-Anführungszeichen, die die Phrase umschließen, Operatorzeichen sind, die der Trennung der Phrase dienen. Es handelt sich hierbei nicht um Anführungszeichen, die den Such-String selbst umfassen.
