Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung

Projekte in den Förderprogrammen des BMEL, betreut durch den Projektträger BLE (ptble)

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Titel: Quantitativer und qualitativer Nachweis von Brandkrankheiten (Tilletia spp., Ustilago nuda) bei Weizen und Gerste mittels biotechnologischer Methoden (q-PCR, LAMP-Technologie)
Titel (englisch): Development of LAMP-based quick tests for the determination of bunt diseases (Tilletia spp., Ustilago nuda) and population genetic studies on T. caries and T. controversa
Beschreibung (dt.): Ziele im hier vorgestellten Projekt sind die Entwicklung hocheffizienter und kostengünstiger Nachweismethoden zur sicheren und schnellen Bestimmung des Befalls mit Tilletia-Arten sowie Ustilago nuda bei Weizen und Gerste. Diese Methoden sollen neben der Bestimmung der Befallshöhe eine eindeutige Identifizierung der Pathogene, insbesondere auch bei Mischinfektionen von T. caries und T. controversa, ermöglichen. Dieses Ziel soll durch die Entwicklung und Optimierung von q-PCR und LAMP basierten Methoden erreicht werden. Die neu entwickelten Methoden werden in umfangreichen Validierungsstudien hinsichtlich Genauigkeit, Robustheit, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit überprüft und verglichen. Anschließend soll die Aufnahme in das Methodenbuch der ISTA erfolgen. Um die gesetzten Ziele zu erreichen, werden im ersten Jahr die q-PCR an der LfL und die LAMP-Technologie am JKI für T. caries, T. controversa, T. indica und Ustilago nuda etabliert. Da für die q-PCR als auch für die LAMP-Technologie z. T. die gleichen Primer verwendet werden können, erfolgt auch eine gemeinsame Primerentwicklung und Validierung, um alle Synergien in der Methodenentwicklung auszuschöpfen. Im zweiten Jahr finden v. a. Validierungsstudien bezüglich der Robustheit des Nachweises der unterschiedlichen Tilletia-Arten und Ustilago nuda sowie der Quantifizierung statt. Es werden verschiedene DNA-Isolationsmethoden getestet und mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Getreidepilzen untersucht. Im dritten Jahr werden an der LfL neben weiteren Validierungsstudien, die Umsetzung größerer Multiplex-Ansätze, und der Vergleich der entwickelten Methoden forciert. Die Methoden mit der größten Robustheit, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit werden zur Aufnahme in das ISTA-Methodenbuch vorgeschlagen. Parallel dazu erfolgt am JKI die Untersuchung der Populationsstruktur von T. caries und T. controversa anhand bereits publizierter und neu zu entwickelnder molekularer Marker (Mikrosatelliten).
Beschreibung (engl.): In the here presented project highly efficient and economically viable methods will be developed to detect seed born smut fungi (Tilletia spp., Ustilago nuda) in wheat and barley. With the help of these methods we are not only aiming at individually and unambiguously identifying the pathogens, also in mixed contaminations of seed lots, but we are also aiming at quantifying the contamination level of seed lots by these fungi. To reach these goals molecular biological methods, based on q-PCR and LAMP, respectively, will be developed and optimised. These methods will be internationally validated and then submitted to the International Seed Testing Association (ISTA) for implementation in the handbook 'International Rules for Seed Testing'. In the first year q-PCR methods will be developed and optimised at the Landesanstalt fu¨r Landwirtschaft (LfL) while LAMP will be established at the Julius Ku¨hn-Institut (JKI). As far as possible primer development and validation of the methods will be performed jointly to take advantage of potential synergies. In the second year validation studies in both institutions LfL and JKI will focus especially on the accuracy and robustness of identification of the different smut fungi and on their quantification. Several DNA-isolation-methods will be tested and potential cross-reactions of the developed methods with other fungal cereal parasites will be investigated. In the third year, more validation studies covering especially reproducibility, and repeatability will be performed at the LfL. Multiplexing of the tests will also play an important role. At JKI population structure of selected T. caries and T. controversa populations will be studied using already published and newly developed molecular markers (microsatellites) for these fungi.
Ergebnis (dt.): Der Steinbrand des Weizens wird verursacht durch Tilletia caries und T. laevis, der Zwergsteinbrand durch T. controversa. Derzeit werden diese Pathogene mittels einer Filtrationsmethode mit anschließender Mikroskopie und Auszählung der Sporen nachgewiesen. Diese Methode ist jedoch sehr zeitaufwändig und die Artbestimmung oft schwierig. Deshalb wurden im Projekt effiziente
molekularbiologische Methoden (qPCR und LAMP) entwickelt. Für die Entwicklung dieser Tests wurden 11 Gesamtgenome der drei sehr nah verwandten Arten sequenziert. Durch die gemeinsame bioinformatische Analyse dieser und 10 weiterer vor kurzem veröffentlichter Genome konnten Loci
identifiziert werden, die für T. controversa beziehungsweise T. caries/T. laevis spezifisch sind. Daraufhin wurden Primer und Protokolle für den spezifischen Nachweis von T. controversa entwickelt und an über 200 Isolaten der drei Arten sowie weiterer pilzlicher Pflanzenpathogene getestet. Beide Methoden waren sehr robust bezüglich ihrer Spezifität und es wurden Vergleichsuntersuchungen in anderen Laboren durchgeführt. Bei der LAMP-Methode erfolgte der qualitative Nachweis über einen Farbumschlag in der Reaktionslösung. Mit der Sonden-basierten qPCR-Methode wurde T. controversa qualitativ und quantitativ an Weizenkörnern nachgewiesen. Die Methode wurde zudem erfolgreich an
Saatgutproben aus der regulären Saatgutuntersuchung überprüft. Die untere Nachweisgrenze des Tests beträgt rechnerisch, bei Analyse von Triplikaten, 0,92 Sporen pro Korn. Die vergleichenden Genomuntersuchungen zeigten eine außergewöhnlich große genetische Übereinstimmung zwischen den drei Arten, insbesondere zwischen T. caries und T. laevis. Basierend auf diesen Daten konnten 41 Mikrosatellitenmarker für populationsgenetische Untersuchungen entwickelt werden. Diese Untersuchungen zeigten unter anderem auf, dass T. controversa-Isolate von Weizen und Isolate von Wildgräsern distinkte Populationen sind. Somit spielen Wildgräser wahrscheinlich keine Rolle als Wirts-Reservoir von T. controversa für die Infektion von Weizen.
Ergebnis (engl.): Common bunt of wheat is caused by Tilletia caries and T. laevis, dwarf bunt is caused by T. controversa. Currently, these pathogens are detected using a filtration method, which comprises microscopic identification and counting of spores. However, the method is very tedious and species identification is
often challenging. Therefore, the project aims were to develop efficient molecular biological methods (qPCR and LAMP). Thus, 11 whole genomes of the three very closely related species were sequenced to develop these tests. These genomes were then analysed together with 10 recently published genomes using bioinformatic tools enabling the detection of suitable genome regions to develop markers for T. controversa and T. caries/T. laevis, respectively. Using these markers specific primers and assays were developed for the specific detection of T. controversa and tested by using more than 200 isolates representing the three bunt species and further fungal plant pathogens. Both the developed qPCR and
LAMP were highly specific and test performance studies involving several labs were conducted. For the LAMP-assay a qualitative colorimetric end point detection of the pathogen was implemented. Using the probe-based qPCR T. controversa could be detected qualitatively and quantitatively on wheat seed. The method was also successfully tested using seed samples from the routine seed testing. The limit of detection of the assay was calculated at 0.92 spores per kernel if triplicates were analysed. The comparative genomic analyses revealed a remarkably high genetic identity of the three species, especially for T. caries and T. laevis. Using this data 41 microsatellites could be developed for biological
population studies. These studies showed that T. controversa isolates from wheat and isolates of wild grasses belong to distinct populations. Thus, wild grasses most likely do not play a role as host reservoir of T. controversa for the infection of wheat.
Laufzeit: Beginn: 01.10.2014 / Ende: 31.12.2019
Ausf. Einrichtung: Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen (JKI) - Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik Braunschweig, Braunschweig
Themenfelder: Pflanzenschutz, Pflanzengesundheit, crop protection, plant health
Förderprogramme: Bundesprogramm ökologischer Landbau und andere Formen nachhaltiger Landwirtschaft
Schlagworte: Biotechnologie, biotechnology, Ackerbau, crop production, Gerste, barley, Pflanzenkrankheiten (Viren, Bakt., Pilze, Phytoplasmen), plant diseases (virusus, bacteria, fungi, phytoplasma), Weizen, wheat, Nachhaltigkeit, sustainability
Förderkennzeichen: 2812NA128
Dokument zum Download: Abschlussbericht.pdf (3,5 MB)

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