Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung

Projekte in den Förderprogrammen des BMEL, betreut durch den Projektträger BLE (ptble)

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Titel: Aufnahme von Escherichia coli und Salmonella enterica in Pflanzen - plantinfect; Teil II
Titel (englisch): Colonization of plants by Escherichia coli and Salmonella enterica
Beschreibung (dt.): Ziel des Vorhabens ist, den Einfluss des Bodentyps, von organischem Dünger sowie der Einarbeitung von belasteten Pflanzenresten in den Boden für die Aufnahme und Verteilung von Salmonella enterica und enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in die Nutzpflanzen aufzuklären. Die Ziele des Vorhabens sind in drei Gruppen unterteilt: i) Etablierung von Methoden für den spezifischen Nachweis von Salmonella und EHEC in pflanzlichen Geweben und im Boden; ii) Untersuchung von Faktoren die den Umfang der Besiedlung von Nutzpflanzen mit Humanpathogenen beeinflussen. Aufgrund der bestehenden Gefährdung für den Verbraucher wird die Besiedelung von Kopfsalat und Feldsalat untersucht; und iii) Risikoeinschätzung für den Verbraucher. In dem Teilvorhaben wird die Bedeutung der genetischen Ausstattung von Salmonella enterica und EHEC bei der Kolonisierung von Pflanzen und der Übertragung über pflanzliche Lebensmittel untersucht. Dabei soll die Rolle von diversen Adhäsionsfaktoren durch gezielte Deletion oder experimentell kontrollierte Expression analysiert werden. Kolonisierung von Wurzel- und Blattgewebe, Biofilmbildung und Persistenz werden dabei quantifiziert (AP2). Der Effekt des Kontakts von S. enterica mit Pflanzengeweben wird über die Veränderungen des Transkriptoms bestimmt. Eine Kollektion von S. enterica Deletionsmutanten wird mit Plasmiden zur Expression von GFP oder dsRed markiert und deren Verbreitung in der Pflanze wird durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit der von Wildtypstämmen vergleichen (AP3). Die Daten zum Zusammenhang zwischen genetischer Ausstattung von S. enterica und EHEC Stämmen und der Übertragungen durch pflanzliche Lebensmittel stellen einen Faktor der Risikoeinschätzung dar (AP4).
Beschreibung (engl.): In recent years, the number of food-born human diseases that are caused by the consumption of vegetables contaminated with human pathogenic bacteria, such as Salmonella and Escherichia coli, is steadily increasing worldwide. The importance of the soil type and its chemical properties for the colonization of the crop plants are currently only poorly understood. Similarly unexplained, remains the role of organic manure or other sources of bacteria, like irrigation water or incorporation of contaminated plant debris into the soil. Furthermore, the knowledge about the activation of crop plants’ defense mechanisms after an infection with human pathogens is missing. Due to the existing threat for the consumer, we will study the influence of these factors on the colonization of lettuce and corn salad with Salmonella enterica and the enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The goals of this research program are divided into three groups: i) establishment of methods for the specific detection of human pathogenic bacteria in plant tissues and in the soil; ii) investigation of factors, which influence the colonization of crop plants; and iii) risk assessment. Studies with S. enterica and EHEC will be performed separately and compared subsequently. The project structures into four work packages: 1. Validation of specific detection methods for Salmonella and EHEC in plants and soil. Adaptation of international methods such as e.g. the DIN CEN ISO / TS 13136 method for EHEC. 2. Impact of organic fertilizers on the abundance and uptake of Salmonella and EHEC into crop plants. 3. Analysis of the distribution of bacteria in the plant by means of microscopy, DNA-based techniques and cultivation-based methods. 4. Risk assessment for the consumer and intervention strategies based on the results. In addition we will perform a comprehensive literature evaluation, which will be published as review articles. In this subproject, the importance of the genetic equipment of Salmonella enterica and EHEC for the colonization of plants and for transmission by vegetables will be investigated. In detail, the role of various adhesive structures will be analyzed by targeted gene deletions or experimentally controlled expression. The colonization of root and leave tissues, biofilm formation and persistence will be quantified (AP2). The effect of contact of S. enterica to plant tissue is determined by transciptome analyses. A collection of S. enterica deletion mutant strains will be modified with plasmids for the expression of GFP or dsRed in order to follow and compare the distribution of wild-type and mutant bacteria in plants using confocal fluorescence microscopy (AP3). The data obtained for the correlation between genetic equipment of S. enterica and EHEP strains and transmission by vegetables are one parameter for the risk assessment (AP4).
Ergebnis (dt.): Humanpathogenen Bakterien (HPB) wie Salmonella enterica oder Escherichia coli sind in der Lage Kulturpflanzen besiedeln. Ein wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Kolonisierung der Pflanze ist das Überleben der HPB im Boden. Faktoren, die das Überleben von HPB im Boden und folglich die Pflanzenbesiedlung beeinflussen können, wie z.B. Bodentyp, organische Düngung, Bodenmikrobiom, genetische Ausstattung der Bakterien und Immunreaktion der Pflanze, sind bisher unzureichend untersucht. Ein Verständnis dieser Faktoren ist für die Bereitstellung von sicheren Frischeprodukten für den Verbraucher zwingend erforderlich. In diesem Projekt konnte gezeigt werden, dass die Populationen der getesteten E. coli und S. enterica in der Lage waren, abhängig vom Bodentyp, mehrere Wochen im Boden zu überleben. Organische Düngung hatte einen positiven Einfluss auf das Überleben von S. enterica, wobei eine hohe mikrobielle Abundanz und Diversität im Boden der Persistenz von S. enterica entgegenwirkte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die getesteten E. coli- und S. enterica-Stämme in der Lage waren Kopf- und Feldsalat über die Wurzel zu kolonisieren. Es zeigte sich, dass Oberflächenstrukturen wie das T3SS, Flagellen und Pili für die Kolonisierung ebenso eine Rolle spielen wie Salatsorte, Bakterienstamm, Bodentyp und Zeitpunkt der Inokulation des Bodens mit HPB. Untersuchung mit GFP-markierten Stämmen zeigten Akkumulationen von Zellen an der Rhizodermis, Wurzelhaarzellen sowie an Austrittsstellen von Sekundärwurzeln, was auf mögliche Internalisierungswege über die Wurzel hindeutet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass S. enterica nach Applikation auf die Blätter in diese eindringen und dort für mehrere Wochen überleben konnte. Ecp-Fimbrien wurden als wichtiger Faktor für die Adhärenz von E. coli an Blätter identifiziert. Nach Wachstum von Kopf- und Feldsalatpflanzen in mit S. enterica-kontaminiertem Boden waren im Mittel bei 0,5-0,9% der Pflanzen Salmonellen in den Blättern nachweisbar, wobei Kopfsalat (0,7-1,4%) im Vergleich zu Feldsalat (0,3-0,4%) deutlich häufiger besiedelt war. Die erzielten Ergebnisse bezüglich der Zahl überdauerter HPB im Boden und der Befallshäufigkeit der Kulturpflanzen lassen ein Zusammenhang vermuten. Allerdings sind weitere Untersuchungen unter praxisnahen Bedingungen erforderlich, um die Zusammenhänge zwischen Zellzahl an HPB in Pflanzenanbausystemen, Bodenmikrobiom und Befallshäufigkeit aufzuklären. Die Transkriptom-Analysen ergaben, dass Flagellen und andere Oberflächenstrukturen eine fundamentale Rolle in der Interaktion von E. coli (EHEC und EHEC/EAEC) mit Pflanzen spielen. S. enterica zeigte eine Reaktion auf Wurzelexudate und Salatextrakte, die der bei der Kolonisierung von Tieren ähnelt und bei der Kolonisierung und Internalisierung von Pflanzen eine Rolle spielen könnte. Derzeit ist nicht klar, warum einzelne Pflanzen bei vergleichbarem Infektionsdruck besiedelt werden und andere nicht. Ein besseres Verständnis der Immunantwort der Pflanze bietet gute Ansatzpunkte für Strategien, um einer Besiedlung mit HPB entgegen zu wirken und dem Verbraucher sichere Lebensmittel zur Verfügung zu stellen.
Ergebnis (engl.): Human pathogenic bacteria (HPB) such as Salmonella enterica or Escherichia coli are able to colonize crop plants. An important aspect of successful colonization of the plant is the survival of HPB in the soil. Factors that may affect the survival in the soil and, consequently, plant colonization, e.g. soil type, organic fertilization, soil microbiome, genetic background of the bacteria and immune response of the plant, have been poorly studied. An understanding of these factors is imperative for the provision of safe fresh produce to the consumer. This project showed that, depending on the soil type, the populations of E. coli and S. enterica were able to survive in the soil for several weeks. Organic fertilization had a positive impact on the survival of S. enterica, while high microbial abundance and diversity in the soil counteracted the S. enterica persistence.
Furthermore, it was shown that the tested E. coli and S. enterica strains were able to colonize lettuce and corn salad through the root tissues. Surface structures such as T3SS, flagella and pili as well as lettuce variety, bacterial strain, soil type and time of soil inoculation with HPB, played an important role in crop colonization. Assays with GFP-labeled strains revealed accumulation of cells on the rhizodermis, root hair cells, and secondary root emerging sites, indicating possible entry sites for the internalization. Furthermore, S. enterica could penetrate into the leaf tissues after inoculation and persist for several weeks. Ecp-fimbriae have been identified as an important factor in the adherence of E. coli to leaves. After the growth of lettuce and corn salad plants in S. enterica-contaminated soil, leaves from an average of 0.5-0.9% of the plants were Salmonella-positive, with lettuce (0.7-1.4%) significantly more colonized than corn salad (0.3-0.4%). The ratio of contaminated plants in relation to the number of surviving HBP in soil suggested a correlation. Further investigations are necessary to elucidate the relationships between cell number of HPB in plant cultivation systems, soil microbiome and frequency of plant colonization. Transcriptome analysis revealed that flagella and other surface structures play a fundamental role in the interaction of E. coli (EHEC and EHEC / EAEC) with plants. S. enterica showed a response to root exudates and plant extracts similar to that found during animal colonization, which may play a role in the colonization and internalization into plants. At the moment, it is not clear why only individual plants were colonized, given a similar infection pressure. A better understanding of the plant's immune response would provide a good basis for strategies to prevent colonization of crop plants by HPB and provide safe food to the consumer.
Laufzeit: Beginn: 01.04.2015 / Ende: 30.09.2018
Ausf. Einrichtung: Universität Osnabrück - Fachbereich Biologie/Chemie - Abt. Mikrobiologie, Osnabrück
Themenfelder: Gesundheitlicher Verbraucherschutz, health-related consumer protection
Förderprogramme: Entscheidungshilfebedarf
Schlagworte: Humanernährung, human nutrition, Lebensmittelsicherheit, food safety, Prävention, Prevention, Gemüsebau, vegetable production, Produktsicherheit, product safety, Mikroorganismen, microorganisms, Düngung, fertilization
Förderkennzeichen: 2813HS027
Dokument zum Download: Abschlussbericht 2813HS027.pdf (5 MB)

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