Projekte in den Förderprogrammen des BMEL, betreut durch den Projektträger BLE (PT BLE)
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| Titel: | Aufnahme von Escherichia coli und Salmonella enterica in Pflanzen - plantinfect; Teil III |
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| Titel (englisch): | Colonization of plants by Escherichia coli and Salmonella enterica |
| Beschreibung (dt.): | Ziel des Vorhabens ist, den Einfluss des Bodentyps, von organischem Dünger sowie der Einarbeitung von belasteten Pflanzenresten in den Boden für die Aufnahme und Verteilung von Salmonella enterica und enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in die Nutzpflanzen aufzuklären. Die Ziele des Vorhabens sind in drei Gruppen unterteilt: i) Etablierung von Methoden für den spezifischen Nachweis von Salmonella und EHEC in pflanzlichen Geweben und im Boden; ii) Untersuchung von Faktoren die den Umfang der Besiedlung von Nutzpflanzen mit Humanpathogenen beeinflussen. Aufgrund der bestehenden Gefährdung für den Verbraucher wird die Besiedelung von Kopfsalat und Feldsalat untersucht; und iii) Risikoeinschätzung für den Verbraucher. In dem Teilvorhaben werden spezifische Nachweisverfahren für EHEC in Pflanzen- und Bodenproben unter besonderer Berücksichtigung des Viable But Non-Culturable (VBNC)-Status etabliert (AP1). Weiterhin soll die Rolle von Adhärenzfaktoren für die Aufnahme der EHEC über das Wurzelgewebe und die Persistenz und Verbreitung in Blattgewebe untersucht werden (AP2). Hierzu werden in zwei EHEC-Stämmen der Serogruppen O157:H- und O104:H4 Gene für Adhärenzfaktoren, die bei der Anheftung an und Verbreitung in Pflanzengewebe von Bedeutung sein können, inaktiviert. Darüber hinaus soll das Transkriptom der Bakterien, die mit Pflanzengeweben in Kontakt kommen, untersucht werden. Ferner soll im S3-Labor untersucht werden, ob EHEC-Bakterien über das Wurzelsystem in die Pflanze aufgenommen werden und wie sie sich dort im Gewebe verteilen (AP3). Neben üblichen Färbe- und Schneidtechniken werden auch EHEC-Bakterien verwendet, die mit dem grünen fluoreszierenden Protein markiert wurden und so unter dem Fluoreszenz-Mikroskop analysiert werden können. Parallel hierzu werden in der Forschungsanstalt Wädenswill im S3-Gewächshaus Inokulationsversuche von Feldsalat mit EHEC-Bakterien unter bestimmten Bodenbedingungen durchgeführt. |
| Beschreibung (engl.): | In recent years, the number of food-born human diseases that are caused by the consumption of vegetables contaminated with human pathogenic bacteria, such as Salmonella and Escherichia coli, is steadily increasing worldwide. The importance of the soil type and its chemical properties for the colonization of the crop plants are currently only poorly understood. Similarly unexplained, remains the role of organic manure or other sources of bacteria, like irrigation water or incorporation of contaminated plant debris into the soil. Furthermore, the knowledge about the activation of crop plants’ defense mechanisms after an infection with human pathogens is missing. Due to the existing threat for the consumer, we will study the influence of these factors on the colonization of lettuce and corn salad with Salmonella enterica and the enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The goals of this research program are divided into three groups: i) establishment of methods for the specific detection of human pathogenic bacteria in plant tissues and in the soil; ii) investigation of factors, which influence the colonization of crop plants; and iii) risk assessment. Studies with S. enterica and EHEC will be performed separately and compared subsequently. The project structures into four work packages: 1. Validation of specific detection methods for Salmonella and EHEC in plants and soil. Adaptation of international methods such as e.g. the DIN CEN ISO / TS 13136 method for EHEC. 2. Impact of organic fertilizers on the abundance and uptake of Salmonella and EHEC into crop plants. 3. Analysis of the distribution of bacteria in the plant by means of microscopy, DNA-based techniques and cultivation-based methods. 4. Risk assessment for the consumer and intervention strategies based on the results. In addition we will perform a comprehensive literature evaluation, which will be published as review articles. In this subproject, specific detection methods for EHEC in plant and soil samples will be established with special emphasis on the viable but non-culturable (vbnc)-state (AP1). We will further investigate the role of adherence factors for uptake of EHEC in root tissues and persistence in leaves (AP2). In order to perform these experiments, adherence factor genes that presumably allow attachment to plant tissues, will be inactivated (deleted) in two EHEC strains of serotypes O157:H- and O104:H4, successively. With these mutants, the uptake into the plant tissues will be studied in comparison to the wild type strains. In addition, we will investigate the transcriptome of bacteria that come in close contact with the plant tissues. In a further approach under level 3-laboratory conditions, it will be analyzed how EHEC-bacteria will be taken up by the roots into the plants and how they persist and distribute in the plant tissues (AP3). Besides classical staining and cutting techniques, bacteria expressing the green-fluorescent protein will be constructed and investigated under the fluorescence microscope. In parallel, experiments on the uptake of wild type and mutant EHEC in field salad will be performed in a level 3 greenhouse at Agroscope in Wädenswill, Switzerland. |
| Ergebnis (dt.): | Humanpathogenen Bakterien (HPB) wie Salmonella enterica oder Escherichia coli sind in der Lage Kulturpflanzen besiedeln. Ein wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Kolonisierung der Pflanze ist das Überleben der HPB im Boden. Faktoren, die das Überleben von HPB im Boden und folglich die Pflanzenbesiedlung beeinflussen können, wie z.B. Bodentyp, organische Düngung, Bodenmikrobiom, genetische Ausstattung der Bakterien und Immunreaktion der Pflanze, sind bisher unzureichend untersucht. Ein Verständnis dieser Faktoren ist für die Bereitstellung von sicheren Frischeprodukten für den Verbraucher zwingend erforderlich. In diesem Projekt konnte gezeigt werden, dass die Populationen der getesteten E. coli und S. enterica in der Lage waren, abhängig vom Bodentyp, mehrere Wochen im Boden zu überleben. Organische Düngung hatte einen positiven Einfluss auf das Überleben von S. enterica, wobei eine hohe mikrobielle Abundanz und Diversität im Boden der Persistenz von S. enterica entgegenwirkte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die getesteten E. coli- und S. enterica-Stämme in der Lage waren Kopf- und Feldsalat über die Wurzel zu kolonisieren. Es zeigte sich, dass Oberflächenstrukturen wie das T3SS, Flagellen und Pili für die Kolonisierung ebenso eine Rolle spielen wie Salatsorte, Bakterienstamm, Bodentyp und Zeitpunkt der Inokulation des Bodens mit HPB. Untersuchung mit GFP-markierten Stämmen zeigten Akkumulationen von Zellen an der Rhizodermis, Wurzelhaarzellen sowie an Austrittsstellen von Sekundärwurzeln, was auf mögliche Internalisierungswege über die Wurzel hindeutet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass S. enterica nach Applikation auf die Blätter in diese eindringen und dort für mehrere Wochen überleben konnte. Ecp-Fimbrien wurden als wichtiger Faktor für die Adhärenz von E. coli an Blätter identifiziert. Nach Wachstum von Kopf- und Feldsalatpflanzen in mit S. enterica-kontaminiertem Boden waren im Mittel bei 0,5-0,9% der Pflanzen Salmonellen in den Blättern nachweisbar, wobei Kopfsalat (0,7-1,4%) im Vergleich zu Feldsalat (0,3-0,4%) deutlich häufiger besiedelt war. Die erzielten Ergebnisse bezüglich der Zahl überdauerter HPB im Boden und der Befallshäufigkeit der Kulturpflanzen lassen ein Zusammenhang vermuten. Allerdings sind weitere Untersuchungen unter praxisnahen Bedingungen erforderlich, um die Zusammenhänge zwischen Zellzahl an HPB in Pflanzenanbausystemen, Bodenmikrobiom und Befallshäufigkeit aufzuklären. Die Transkriptom-Analysen ergaben, dass Flagellen und andere Oberflächenstrukturen eine fundamentale Rolle in der Interaktion von E. coli (EHEC und EHEC/EAEC) mit Pflanzen spielen. S. enterica zeigte eine Reaktion auf Wurzelexudate und Salatextrakte, die der bei der Kolonisierung von Tieren ähnelt und bei der Kolonisierung und Internalisierung von Pflanzen eine Rolle spielen könnte. Derzeit ist nicht klar, warum einzelne Pflanzen bei vergleichbarem Infektionsdruck besiedelt werden und andere nicht. Ein besseres Verständnis der Immunantwort der Pflanze bietet gute Ansatzpunkte für Strategien, um einer Besiedlung mit HPB entgegen zu wirken und dem Verbraucher sichere Lebensmittel zur Verfügung zu stellen. |
| Ergebnis (engl.): | Human pathogenic bacteria (HPB) such as Salmonella enterica or Escherichia coli are able to colonize crop plants. An important aspect of successful colonization of the plant is the survival of HPB in the soil. Factors that may affect the survival in the soil and, consequently, plant colonization, e.g. soil type, organic fertilization, soil microbiome, genetic background of the bacteria and immune response of the plant, have been poorly studied. An understanding of these factors is imperative for the provision of safe fresh produce to the consumer. This project showed that, depending on the soil type, the populations of E. coli and S. enterica were able to survive in the soil for several weeks. Organic fertilization had a positive impact on the survival of S. enterica, while high microbial abundance and diversity in the soil counteracted the S. enterica persistence. Furthermore, it was shown that the tested E. coli and S. enterica strains were able to colonize lettuce and corn salad through the root tissues. Surface structures such as T3SS, flagella and pili as well as lettuce variety, bacterial strain, soil type and time of soil inoculation with HPB, played an important role in crop colonization. Assays with GFP-labeled strains revealed accumulation of cells on the rhizodermis, root hair cells, and secondary root emerging sites, indicating possible entry sites for the internalization. Furthermore, S. enterica could penetrate into the leaf tissues after inoculation and persist for several weeks. Ecp-fimbriae have been identified as an important factor in the adherence of E. coli to leaves. After the growth of lettuce and corn salad plants in S. enterica-contaminated soil, leaves from an average of 0.5-0.9% of the plants were Salmonella-positive, with lettuce (0.7-1.4%) significantly more colonized than corn salad (0.3-0.4%). The ratio of contaminated plants in relation to the number of surviving HBP in soil suggested a correlation. Further investigations are necessary to elucidate the relationships between cell number of HPB in plant cultivation systems, soil microbiome and frequency of plant colonization. Transcriptome analysis revealed that flagella and other surface structures play a fundamental role in the interaction of E. coli (EHEC and EHEC / EAEC) with plants. S. enterica showed a response to root exudates and plant extracts similar to that found during animal colonization, which may play a role in the colonization and internalization into plants. At the moment, it is not clear why only individual plants were colonized, given a similar infection pressure. A better understanding of the plant's immune response would provide a good basis for strategies to prevent colonization of crop plants by HPB and provide safe food to the consumer. |
| Laufzeit: | Beginn: 01.04.2015 / Ende: 30.09.2018 |
| Ausf. Einrichtung: | Universität Hohenheim - Fakultät Naturwissenschaften - Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie - Fachgebiet Lebensmittelmikrobiologie und -hygiene, Stuttgart |
| Themenfelder: | Gesundheitlicher Verbraucherschutz, health-related consumer protection |
| Förderprogramme: | Entscheidungshilfebedarf |
| Schlagworte: | Humanernährung, human nutrition, Lebensmittelsicherheit, food safety, Prävention, Prevention, Gemüsebau, vegetable production, Produktsicherheit, product safety, Mikroorganismen, microorganisms, Düngung, fertilization |
| Förderkennzeichen: | 2813HS028 |
| Dokument zum Download: | Abschlussbericht 2813HS028.pdf (5 MB) |
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